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东华大学史向阳教授课题组在阳离子型含磷树状大分子用于肿瘤基因治疗上取得新进展
2020-05-17  来源:高分子科技

  基因传递的成功依赖于高效无毒的载体。病毒载体的免疫原性或致癌性大大限制了其在基因传递中的应用,而非病毒载体如线性阳离子聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)或聚丙烯亚胺树状大分子、阳离子脂质体和阳离子多肽等由于其低毒性而受到研究者的青睐。这些非病毒载体可通过静电作用与带负电荷的基因形成结构紧凑的、带正电荷的复合物,进而实现基因的有效传递。


  在众多的非病毒载体体系中,具有生物相容性骨架的含磷树状大分子已被应用于生物医学领域,如抗朊病毒药物、抗HIV药物和人自然杀伤细胞激活剂等。基于含磷树状大分子的研究现状,东华大学史向阳教授团队和法国国家科学研究中心Jean-Pierre Majoral教授团队合作设计构建了不同代数的、不同环胺封端的阳离子型含磷树状大分子(Cationic Phosphorus Dendrimers, CPD),并深入系统地研究了其在基因传递及肿瘤治疗方面的应用。合作团队以环三聚磷腈为核,通过层层修饰的方法合成了不同代数的含磷树状大分子,外围通过取代反应修饰吡咯或哌啶环并质子化,最终制备得到了阳离子型含磷树状大分子(图1)。


图 1. 阳离子型含磷树状大分子的合成示意图


  首先,研究团队以编码增强型绿色荧光蛋白的质粒(pDNA-EGFP)为报告基因,研究了CPD/pDNA-EGFP的细胞毒性及其基因传递效率。实验结果显示,所有的CPD/pDNA-EGFP复合物在给定浓度范围内均表现出良好的细胞相容性。在相同条件下,表面修饰1-(2-氨基乙基)吡咯烷并质子化的第一代含磷树状大分子(1-G1)对HeLa细胞的基因传递效率最佳(图2)。


图 2. CPD/pDNA复合物的(A)水合粒径和(B)表面电势;(C-G)不同浓度下CPD及其pDNA复合物的细胞毒性测试(以HeLa细胞为模型);(H) CPD/pDNA-EGFP复合物基因转染示意图(以1-G1为例);(I)流式细胞术检测不同N/P比条件下CPD/pDNA-EGFP复合物在HeLa细胞中EGFP(增强绿色荧光蛋白)的相对表达量。


  为了更进一步的探索CPD在基因治疗中的应用,研究团队以筛选后得到的1-G1作为载体,转染同时编码EGFP和p53蛋白的质粒(pDNA-p53),用于肿瘤细胞的基因治疗。流式细胞术结果显示,在优化的条件下,HeLa细胞经1-G1/pDNA-p53处理后,其细胞周期发生明显改变。与此同时,实时定量PCR及蛋白质印迹结果也表明,1-G1/pDNA-p53实验组中p53的mRNA和蛋白表达量有明显升高;同时p53的下游调控基因p21及细胞周期调控因子的表达量也发生了相应改变。因而1-G1/pDNA-p53复合物能够在癌细胞内转染并高效表达p53蛋白引起癌细胞凋亡(图3)。


图 3. PBS、1-G1、free pDNA-p53和1-G1/pDNA-p53对HeLa细胞周期及相关细胞周期因子表达的影响。(A)流式细胞术细胞周期分布图;(B)流式细胞术细胞周期结果分析直方图;(C)G0/G1期相关mRNA的实时定量PCR结果直方图;(D)G0/G1期相关蛋白的蛋白质印迹结果;(E)蛋白质印迹结果的分析直方图。


  随后,研究团队更深入地研究了CPD用于皮下移植瘤模型基因治疗的可能性。研究发现,1-G1/pDNA-p53治疗组中,p53、p21蛋白表达水平均高于其他各组(p < 0.001),且细胞周期因子Cdk-4和cyclind1表达水平低于其他各组,与体外基因传递数据一致(图4)。这些结果表明,制备的阳离子型含磷树状大分子(1-G1)有可能作为一种高效载体系统用于癌症基因治疗或其它疾病的基因治疗。


图 4.(A)1-G1/pDNA-p53复合物体内肿瘤基因治疗示意图;(B)经生理盐水(normal saline, NS)、1-G1、free pDNA-p53 和 1-G1/pDNA-p53治疗后,皮下瘤中相关蛋白的免疫印迹结果;(C)蛋白质印迹结果的分析直方图。


  以上研究以“Revisiting Cationic Phosphorus Dendrimers as a Nonviral Vector for Optimized Gene Delivery Towards Cancer Therapy Applications”为题,发表在美国化学会期刊Biomacromolecules (DOI: 10。1021/acs。biomac。0c00458)上。东华大学化学化工与生物工程学院博士研究生陈亮李锦为共同第一作者,东华大学史向阳教授、法国国家科学研究中心Jean-Pierre Majoral教授和巴黎第五大学Serge Mignani教授为共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、上海市科委和中法蔡元培等项目的资助。


  论文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00458

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